PRODH Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403063-ACT

Il gene umano **PRODH** codifica la prolina deidrogenasi (prolina ossidasi), una flavoproteina mitocondriale che catalizza il primo passaggio, limitante la velocità, del catabolismo della prolina convertendo la prolina in **Δ1-pirrolina-5-carbossilato**, collegando l’utilizzo degli amminoacidi al ciclo del TCA e all’equilibrio redox cellulare. Attraverso la modulazione del trasferimento di elettroni alla catena respiratoria, PRODH influenza il metabolismo mitocondriale, la segnalazione mediata dalle specie reattive dell’ossigeno e l’adattamento bioenergetico durante lo stress nutrizionale. L’attività di PRODH interseca il ciclo prolina–P5C e reti più ampie del metabolismo degli amminoacidi che influenzano apoptosi, autofagia e risposte allo stress ossidativo. La disregolazione di PRODH è stata associata a fenotipi metabolici e neuropsichiatrici, e il metabolismo alterato della prolina viene spesso studiato nel contesto del metabolismo tumorale e in modelli di disfunzione mitocondriale.

PRODH Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PRODH senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PRODH Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PRODH nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PRODH, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PRODH. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PRODH nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PRODH nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PRODH nelle cellule tumorali con espressione di PRODH silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.