PP2B-Aβ Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402853-ACT

PPP3CB codifica la subunità catalitica beta della calcineurina (PP2B-Aβ), una fosfatasi serina/treonina Ca2+/calmodulina-dipendente che collega i segnali intracellulari del calcio a risposte trascrizionali e post-traduzionali. La calcineurina defosforila i fattori di trascrizione della famiglia NFAT per regolare programmi genici coinvolti nella segnalazione immunitaria, nella plasticità sinaptica e nell’adattamento allo stress cellulare, e interagisce inoltre con le vie MAPK e Wnt e con i processi di rimodellamento del citoscheletro. Un’attività di PPP3CB deregolata è stata associata ad alterazioni dell’eccitabilità neuronale e a fenotipi di neurosviluppo, e la segnalazione aberrante della calcineurina è oggetto di studio nell’infiammazione, nell’ipertrofia dei cardiomiociti e nelle transizioni di stato delle cellule tumorali. In quanto nodo centrale della segnalazione dipendente dal calcio, PP2B-Aβ rappresenta uno strumento maneggevole per analizzare i circuiti trascrizionali dipendenti dal segnale e le reti regolamentate dalle fosfatasi.

PP2B-Aβ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PPP3CB senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PP2B-Aβ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PPP3CB nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PPP3CB, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PP2B-Aβ. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PPP3CB nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PP2B-Aβ nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PP2B-Aβ nelle cellule tumorali con espressione di PPP3CB silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.