PKA IIβ reg Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402536-ACT

PRKAR2B codifica la subunità regolatoria IIβ della proteina chinasi A (PKA) dipendente da cAMP, un modulatore chiave dell’attività della subunità catalitica e della localizzazione subcellulare in risposta al cAMP. Attraverso una segnalazione compartimentalizzata, spesso coordinata dalle proteine di ancoraggio della chinasi A (AKAP), PRKAR2B contribuisce a plasmare le dinamiche di fosforilazione che influenzano il metabolismo, l’organizzazione del citoscheletro, i programmi trascrizionali e la segnalazione sinaptica. Le vie dipendenti da PKA intersecano la segnalazione mediata da GPCR, la regolazione genica mediata da CREB e le reti responsive allo stress che controllano proliferazione e differenziazione cellulare. In letteratura, una segnalazione cAMP/PKA deregolata che coinvolge PRKAR2B è stata associata a fenotipi metabolici alterati e a processi neurocomportamentali, a supporto della sua rilevanza per lo studio dell’integrazione dei segnali in contesti patologici.

PKA IIβ reg Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PRKAR2B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PKA IIβ reg Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PRKAR2B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PRKAR2B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PKA IIβ reg. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PRKAR2B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PKA IIβ reg nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PKA IIβ reg nelle cellule tumorali con espressione di PRKAR2B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.