Phox2b Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401351-ACT

PHOX2B codifica il fattore di trascrizione homeobox Phox2b, un regolatore determinante del lignaggio, necessario per la specificazione e il mantenimento dei programmi neuronali autonomici e noradrenergici durante lo sviluppo. Phox2b coordina reti trascrizionali che governano la differenziazione neuronale, la guida assonale e l’espressione di geni catecolaminergici, includendo vie associate ai destini cellulari derivati dalla cresta neurale e ai circuiti del tronco encefalico che controllano la respirazione. Alterazioni genetiche o un’espressione deregolata di PHOX2B sono collegate alle neurocristopatie e ai tumori pediatrici della cresta neurale, inclusa la sindrome da ipoventilazione centrale congenita e alcuni sottotipi di neuroblastoma. Queste caratteristiche rendono PHOX2B un nodo chiave per lo studio del controllo trascrizionale dello sviluppo del sistema nervoso autonomo e degli stati di differenziazione neuronale rilevanti per la malattia.

Phox2b Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PHOX2B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Phox2b Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PHOX2B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PHOX2B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Phox2b. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PHOX2B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Phox2b nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Phox2b nelle cellule tumorali con espressione di PHOX2B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.