PHF5A Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-407986-LAC

PHF5A codifica la proteina 5A con dito PHD, un componente essenziale del sottocomplesso SF3b all’interno della piccola ribonucleoproteina nucleare U2, che supporta lo splicing del pre‑mRNA e l’assemblaggio dello spliceosoma. Contribuendo a definire il riconoscimento del sito di splicing 3′, PHF5A influenza le decisioni di splicing alternativo che si collegano al controllo trascrizionale, alla progressione del ciclo cellulare e alle risposte al danno al DNA. L’alterazione dello splicing dipendente da PHF5A può rimodellare il panorama delle isoforme trascrittiche e modificare l’espressione di geni coinvolti nella proliferazione e nel mantenimento del genoma. La disfunzione dello spliceosoma e la selezione aberrante dei siti di splicing sono spesso implicate nella biologia del cancro e in altri disturbi caratterizzati da un processamento dell’RNA anomalo, rendendo PHF5A un nodo rilevante per studi meccanicistici.

Le particelle di attivazione lentivirale PHF5A (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di PHF5A in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale PHF5A (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione PHF5A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di PHF5A. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo PHF5A e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.