PGC1a Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400070-ACT

PPARGC1A codifica il coattivatore trascrizionale PGC1α, un regolatore centrale della biogenesi mitocondriale e del metabolismo ossidativo nelle cellule umane. PGC1α integra segnali provenienti da vie di sensing energetico e di risposta allo stress, incluse AMPK e la segnalazione dipendente dalle sirtuine, per coordinare programmi trascrizionali che controllano l’ossidazione degli acidi grassi, la fosforilazione ossidativa e le difese antiossidanti, tramite partner quali PPAR, ERR e NRF1/2. Un’attività alterata di PPARGC1A/PGC1α è stata associata a disfunzioni metaboliche e a un’alterata bioenergetica cellulare, ed è frequentemente studiata in contesti quali insulino-resistenza, obesità, neurodegenerazione ed energetica dei cardiomiociti. In quanto nodo che collega la disponibilità di nutrienti al controllo trascrizionale, PGC1α è ampiamente utilizzata per investigare la funzione mitocondriale, l’omeostasi redox e le risposte adattative allo stress fisiologico.

PGC1a Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PPARGC1A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PGC1a Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PPARGC1A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PPARGC1A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PGC1a. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PPARGC1A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PGC1a nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PGC1a nelle cellule tumorali con espressione di PPARGC1A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.