Ob Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400706-ACT

Il gene umano **LEP** codifica l’adipokina leptina (Ob), un regolatore endocrino chiave dell’equilibrio energetico che comunica all’ipotalamo lo stato nutrizionale del tessuto adiposo per modulare appetito e dispendio energetico. La segnalazione della leptina è mediata principalmente dall’attivazione di **JAK2/STAT3** guidata da **LEPR** e interseca le vie **PI3K–AKT** e **MAPK**, influenzando l’omeostasi del glucosio, il metabolismo lipidico e la funzione neuroendocrina. Nei tessuti periferici, la leptina modella anche i processi immunitari e infiammatori, collegando lo stato metabolico alla segnalazione citochinica e all’attività delle cellule immunitarie. Un’espressione deregolata di **LEP** o la resistenza alla leptina è associata a fenotipi metabolici correlati all’obesità e, più in generale, alla biologia delle malattie cardiometaboliche e infiammatorie, rendendo **LEP** un nodo centrale per studi meccanicistici.

Ob Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di LEP senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Ob Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus LEP nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione LEP, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Ob. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus LEP nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Ob nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Ob nelle cellule tumorali con espressione di LEP silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.