Notch 3 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-421933-ACT

Il gene murino Notch3 codifica il recettore Notch 3, un regolatore trascrizionale transmembrana a singolo passaggio che viene attivato da una scissione proteolitica dipendente dal ligando e dalla successiva traslocazione nel nucleo del dominio intracellulare di Notch. Nelle cellule muscolari lisce vascolari e nei periciti, la segnalazione di NOTCH3 contribuisce a controllare le decisioni di destino cellulare, la maturazione e la stabilità dei vasi attraverso la trascrizione canonica mediata da RBPJ e l’interazione con vie di segnalazione quali TGF-β, PDGFR e MAPK. Un’attività alterata di Notch3 è associata a programmi di differenziamento deregolati e a risposte di rimodellamento nella biologia cardiovascolare e neurovascolare, ed è inoltre spesso studiata in contesti di plasticità di linea e di reti di segnalazione delle cellule tumorali. Di conseguenza, Notch3 è un bersaglio comune per indagare la segnalazione dello sviluppo, la comunicazione cellula-cellula e le transizioni degli stati trascrizionali in sistemi modello murini.

Notch 3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Notch3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Notch 3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Notch3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Notch3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Notch 3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Notch3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Notch 3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Notch 3 nelle cellule tumorali con espressione di Notch3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.