Notch 2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401323-ACT

NOTCH2 codifica Notch 2, un recettore transmembrana a singolo passaggio che media la segnalazione juxtacrina, controllando le decisioni sul destino cellulare, l’impegno di linea e l’omeostasi tissutale. Dopo il legame con il ligando (ad es. JAGGED/Delta-like), la proteolisi rilascia il dominio intracellulare di Notch, che regola la trascrizione insieme a CSL/RBPJ e coattivatori, integrandosi con vie come Wnt, TGF-β e NF-κB. L’attività di Notch 2 influenza l’equilibrio tra proliferazione e differenziamento, il mantenimento di cellule staminali/progenitrici e lo sviluppo delle cellule immunitarie, con effetti dipendenti dal contesto nei diversi sistemi d’organo. Una segnalazione NOTCH2 deregolata è associata a disturbi dello sviluppo ed è stata implicata in processi oncogeni e infiammatori, sostenendone lo studio in ambito di differenziamento, segnalazione del microambiente e modellizzazione di malattia.

Notch 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NOTCH2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Notch 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NOTCH2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NOTCH2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Notch 2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NOTCH2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Notch 2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Notch 2 nelle cellule tumorali con espressione di NOTCH2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.