Plasmide CRISPR d'Activation (h) NCCT: sc-402965-ACT

SLC12A3 code pour le cotransporteur électroneutre Na⁺/Cl⁻ NCCT (NCC), localisé à la membrane apicale des cellules épithéliales du tubule contourné distal, où il assure la réabsorption du sodium et du chlorure et contribue à l’homéostasie électrolytique ainsi qu’à la régulation de la pression artérielle. L’activité de NCCT s’intègre aux réseaux rénaux de gestion du sel impliquant la signalisation des kinases WNK–SPAK/OSR1, qui module la phosphorylation, le trafic et l’abondance membranaire du transporteur. Les variations génétiques ou l’expression altérée de SLC12A3 sont associées à des tubulopathies héréditaires avec perte de sel, telles que le syndrome de Gitelman, et ont été étudiées dans le contexte de la susceptibilité à l’hypertension et des phénotypes rénaux électrolytiques. En tant que transporteur fortement exprimé dans le rein, NCCT constitue une cible exploitable pour étudier le transport ionique épithélial, la polarité cellulaire et la signalisation osmorégulatrice dans des systèmes modèles humains.

NCCT Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SLC12A3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NCCT Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SLC12A3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SLC12A3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NCCT. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SLC12A3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NCCT au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NCCT dans les cellules tumorales présentant une expression de SLC12A3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.