NCCT Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402965-ACT

SLC12A3 codifica NCCT (NCC), un cotrasportatore elettroneutro Na⁺/Cl⁻ localizzato sulla membrana apicale delle cellule epiteliali del tubulo contorto distale, dove media il riassorbimento di sodio e cloruro e contribuisce all’omeostasi elettrolitica e alla regolazione della pressione arteriosa. L’attività di NCCT è integrata nelle reti renali di gestione del sale che coinvolgono la segnalazione chinasica WNK–SPAK/OSR1, la quale modula la fosforilazione, il traffico e l’abbondanza del trasportatore in membrana. La variazione genetica o l’alterata espressione di SLC12A3 è associata a tubulopatie ereditarie con perdita di sali, come la sindrome di Gitelman, ed è stata studiata anche in relazione alla suscettibilità all’ipertensione e a fenotipi renali degli elettroliti. In quanto trasportatore arricchito nel rene, NCCT rappresenta un nodo agevole da studiare per analizzare il trasporto ionico epiteliale, la polarità cellulare e la segnalazione osmoregolatoria in sistemi modello umani.

NCCT Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC12A3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NCCT Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC12A3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC12A3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NCCT. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC12A3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NCCT nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NCCT nelle cellule tumorali con espressione di SLC12A3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.