N-RAP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-408143-ACT

NRAP umano codifica N-RAP, un’impalcatura citoscheletrica arricchita nel muscolo striato che coordina l’assemblaggio delle miofibrille collegando i filamenti di actina con strutture contenenti α-actinina nei dischi Z e nei costameri in formazione. Attraverso interazioni con proteine sarcomeriche e associate alla membrana, N-RAP sostiene l’organizzazione dell’architettura contrattile e i processi di meccanotrasduzione che modellano la differenziazione e la stabilità delle cellule muscolari. Un’espressione alterata di NRAP o varianti del gene sono state associate a disfunzioni del muscolo cardiaco e scheletrico in contesti genetici e di rimodellamento, rendendolo rilevante per le vie che regolano il mantenimento del sarcomero, l’adattamento allo stress e i programmi genici specifici del muscolo. NRAP è quindi frequentemente studiato in modelli di miopatia e cardiomiopatia, nonché in sistemi che indagano il rimodellamento del citoscheletro e la maturazione muscolare.

N-RAP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NRAP senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

N-RAP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NRAP nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NRAP, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di N-RAP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NRAP nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da N-RAP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via N-RAP nelle cellule tumorali con espressione di NRAP silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.