mitochondrial ferritin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401694-ACT

FTMT codifica la ferritina mitocondriale, una proteina di deposito del ferro intramitocondriale che sequestra il ferro ferroso e limita la formazione di specie reattive dell’ossigeno catalizzata dal ferro. Tamponando il ferro labile all’interno della matrice mitocondriale, FTMT influenza l’omeostasi del ferro, il metabolismo dell’eme e dei cluster ferro-zolfo, nonché l’equilibrio redox mitocondriale più generale. Un’alterata espressione di FTMT è stata collegata alla vulnerabilità cellulare in condizioni di stress ossidativo ed è studiata in contesti di neurodegenerazione, disregolazione del ferro associata all’anemia e disfunzione mitocondriale. In quanto regolatore chiave del ferro mitocondriale, FTMT viene spesso indagato per il suo impatto sulla respirazione, sulla rimodellazione metabolica e sulla segnalazione delle risposte allo stress.

mitochondrial ferritin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FTMT senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

mitochondrial ferritin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FTMT nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FTMT, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di mitochondrial ferritin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FTMT nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da mitochondrial ferritin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via mitochondrial ferritin nelle cellule tumorali con espressione di FTMT silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.