MC3-R Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403341-ACT

MC3R codifica il recettore della melanocortina-3 (MC3-R), un recettore accoppiato a proteine G che risponde ai peptidi melanocortinici per regolare l’omeostasi energetica, la ripartizione dei nutrienti e la segnalazione neuroendocrina. In seguito al legame con il ligando, MC3-R si accoppia prevalentemente a Gs, aumentando i livelli di cAMP e attivando programmi trascrizionali dipendenti da PKA/CREB, con effetti a valle sui circuiti ipotalamici e sul metabolismo periferico. L’attività di MC3R è collegata a vie che integrano l’appetito, i ritmi circadiani e i comportamenti legati all’alimentazione, oltre a segnali infiammatori nei tessuti metabolici. Alterazioni genetiche e funzionali di MC3R sono state associate a fenotipi di regolazione del peso corporeo e a disfunzioni metaboliche, a supporto della sua rilevanza negli studi sulla biologia dell’obesità e sui tratti cardiometabolici correlati.

MC3-R Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MC3R senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MC3-R Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MC3R nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MC3R, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MC3-R. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MC3R nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MC3-R nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MC3-R nelle cellule tumorali con espressione di MC3R silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.