MAD2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401027-ACT

MAD2L1 umano codifica MAD2, un componente fondamentale del checkpoint di assemblaggio del fuso mitotico, che monitora l’aggancio tra cinetocori e microtubuli e ritarda l’inizio dell’anafase finché i cromosomi non raggiungono la biorientazione. MAD2 partecipa alla formazione del complesso di controllo mitotico (MCC) per inibire l’attività di APC/C-CDC20, coordinando così la stabilità della ciclina B e della securina, la segregazione cromosomica e il mantenimento dell’integrità genomica. La deregolazione dell’espressione di MAD2L1 o della segnalazione del checkpoint può favorire l’instabilità cromosomica e l’aneuploidia, caratteristiche frequentemente osservate nella biologia delle malattie proliferative. Di conseguenza, MAD2L1 è ampiamente studiato nei pathway che controllano la progressione del ciclo cellulare, la tempistica della mitosi e la sorveglianza del genoma.

MAD2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MAD2L1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MAD2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MAD2L1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MAD2L1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MAD2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MAD2L1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MAD2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MAD2 nelle cellule tumorali con espressione di MAD2L1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.