LSR Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401518-ACT

L’LSR umano (lipolysis stimulated lipoprotein receptor), noto anche come angulin-1, è una proteina associata alla membrana che partecipa alla gestione di lipidi e lipoproteine e contribuisce all’organizzazione della barriera epiteliale nelle giunzioni serrate tricellulari. Coordinando l’architettura giunzionale e il traffico di membrana, LSR influenza la polarità cellulare, la permeabilità paracellulare e l’omeostasi tissutale negli epiteli che svolgono funzione di barriera. Un’alterata espressione di LSR è stata collegata a una disregolazione del metabolismo lipidico e a disfunzioni della barriera, processi rilevanti per l’infiammazione, i disturbi metabolici e i cambiamenti associati ai tumori nell’integrità epiteliale. Queste funzioni rendono LSR un nodo utile per studiare il cross-talk tra le vie lipidiche e le reti di segnalazione delle giunzioni.

LSR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di LSR senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

LSR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus LSR nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione LSR, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di LSR. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus LSR nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da LSR nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via LSR nelle cellule tumorali con espressione di LSR silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.