Latrophilin-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-408830-ACT

ADGRL1 codifica la latrofilina-1, un recettore accoppiato a proteina G di adesione (GPCR) arricchito nel sistema nervoso, che collega segnali extracellulari di adesione cellulare alla segnalazione intracellulare. Attraverso interazioni con le teneurine, le proteine FLRT e le vie intracellulari mediate da proteine G, la latrofilina-1 contribuisce alla formazione delle sinapsi, alla crescita dei neuriti e al perfezionamento dei circuiti dipendente dall’attività. Gli effetti a valle includono la modulazione della segnalazione mediata da cAMP e delle proteine della famiglia Rho, il rimodellamento del citoscheletro e i processi di traffico vescicolare che plasmano la connettività neuronale. La disregolazione di ADGRL1 è stata associata a fenotipi di neuro-sviluppo e a un’alterata organizzazione sinaptica, a supporto della sua rilevanza negli studi meccanicistici della funzione cerebrale e delle vie coinvolte nelle malattie.

Latrophilin-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ADGRL1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Latrophilin-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ADGRL1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ADGRL1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Latrophilin-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ADGRL1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Latrophilin-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Latrophilin-1 nelle cellule tumorali con espressione di ADGRL1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.