KIR6.1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401477-ACT

KCNJ8 codifica per la subunità del canale del potassio a rettificazione entrante KIR6.1, un componente fondamentale dei canali del potassio sensibili all’ATP (KATP), che collegano lo stato metabolico cellulare all’eccitabilità di membrana. In complesso con le subunità del recettore delle sulfoniluree (ABCC8/ABCC9), KIR6.1 regola l’efflusso di potassio in risposta al rapporto intracellulare ATP/ADP, modellando il potenziale di membrana, l’ingresso di calcio e la segnalazione a valle che controlla il tono vascolare e la contrattilità della muscolatura liscia. Questi canali sono parte integrante dei meccanismi di sensing metabolico e delle vie di risposta allo stress in tessuti eccitabili e non eccitabili, influenzando la funzione mitocondriale e la bioenergetica cellulare. Alterazioni dell’attività di KCNJ8/KIR6.1 sono state associate a fenotipi cardiovascolari e legati all’eccitabilità, a sostegno della sua rilevanza negli studi sulle canalopatie e sui meccanismi delle malattie cardiometaboliche.

KIR6.1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KCNJ8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

KIR6.1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KCNJ8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KCNJ8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di KIR6.1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KCNJ8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da KIR6.1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via KIR6.1 nelle cellule tumorali con espressione di KCNJ8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.