IP3R-III Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402138-ACT

ITPR3 codifica il recettore per l’inositolo 1,4,5-trifosfato di tipo 3 (IP3R-III), un canale di rilascio del Ca²⁺ del reticolo endoplasmatico che si apre in risposta a IP3 generato a valle della segnalazione mediata dalla fosfolipasi C. Modulando le oscillazioni intracellulari di Ca²⁺ e la segnalazione in microdomini, IP3R-III regola la secrezione, la polarità epiteliale, il metabolismo mitocondriale e programmi trascrizionali dipendenti dal Ca²⁺. La funzione di IP3R-III si interseca con le vie dei GPCR e dei recettori tirosin-chinasici, collegando i segnali extracellulari alla dinamica del Ca²⁺ del RE e a effettori a valle quali le chinasi dipendenti dalla calmodulina e la segnalazione NFAT. Alterazioni dell’espressione di ITPR3 o dell’omeostasi del Ca²⁺ sono state associate a proliferazione deregolata, risposte allo stress e rimodellamento epiteliale in diversi contesti rilevanti per la malattia, a supporto di studi meccanicistici delle reti di segnalazione del Ca²⁺.

IP3R-III Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ITPR3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

IP3R-III Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ITPR3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ITPR3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di IP3R-III. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ITPR3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da IP3R-III nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via IP3R-III nelle cellule tumorali con espressione di ITPR3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.