IP3R-II Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401067-ACT

ITPR2 codifica il recettore umano per l’inositolo 1,4,5-trifosfato di tipo 2 (IP3R-II), un canale di rilascio di Ca2+ della membrana del reticolo endoplasmatico (RE) che converte i segnali mediati da IP3 a valle della fosfolipasi C in transitori di calcio citosolici. Il flusso di calcio mediato da IP3R-II modula l’accoppiamento eccitazione–contrazione, la secrezione, il metabolismo e i programmi trascrizionali attraverso effettori Ca2+-dipendenti come calmodulina, CaMK, calcineurina/NFAT e l’uptake mitocondriale di calcio. Questo nodo di segnalazione integra input provenienti da vie attivate da GPCR e da recettori tirosin-chinasici e contribuisce all’accoppiamento del calcio tra organelli nei siti di contatto RE–mitocondri. Un’attività deregolata di IP3R-II e un’alterata omeostasi del calcio sono state implicate in studi meccanicistici della fisiologia cardiovascolare ed epiteliale e in ricerche su disturbi che coinvolgono una segnalazione del calcio aberrante, inclusi fenotipi associati ad aritmie e contesti di segnalazione proliferativa o infiammatoria.

IP3R-II Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ITPR2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

IP3R-II Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ITPR2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ITPR2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di IP3R-II. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ITPR2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da IP3R-II nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via IP3R-II nelle cellule tumorali con espressione di ITPR2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.