IDO Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400495-ACT

L’IDO1 umano codifica l’indoleamina 2,3-diossigenasi (IDO), un enzima eme-dipendente e limitante della velocità della via della chinurenina, che catalizza la scissione ossidativa del triptofano in N-formilchinurenina. Controllando la disponibilità locale di triptofano e generando metaboliti bioattivi della chinurenina, IDO influenza le risposte cellulari allo stress, la segnalazione immunitaria e il crosstalk metabolico all’interno del microambiente tissutale. L’espressione di IDO1 è inducibile da segnali infiammatori, in particolare da vie guidate dagli interferoni, ed è spesso studiata in contesti in cui la regolazione metabolica si interseca con la presentazione dell’antigene e i meccanismi di tolleranza. Un’attività deregolata di IDO1 è stata associata alla biologia delle malattie infiammatorie e alle interazioni tra tumore e sistema immunitario, rendendolo un nodo utile per studi meccanicistici dell’immunometabolismo.

IDO Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di IDO1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

IDO Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus IDO1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione IDO1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di IDO. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus IDO1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da IDO nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via IDO nelle cellule tumorali con espressione di IDO1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.