Hugl-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403441-ACT

LLGL1 codifica la proteina umana Hugl-1, un regolatore conservato della polarità delle cellule epiteliali e dell’organizzazione della membrana basolaterale. Hugl-1 opera all’interno delle reti di polarità apico–basale che coordinano l’integrità delle giunzioni, la divisione cellulare asimmetrica e l’organizzazione del citoscheletro, influenzando così l’architettura tissutale e la differenziazione. L’alterazione del controllo della polarità è associata a migrazione e comportamento invasivo modificati, rendendo LLGL1 un nodo rilevante per studi sull’omeostasi epiteliale, la morfogenesi e la perdita di polarità associata ai tumori. L’espressione e la localizzazione di LLGL1 vengono inoltre utilizzate per analizzare il cross-talk di segnalazione tra i moduli di polarità e le vie che regolano proliferazione e adesione cellula–cellula.

Hugl-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di LLGL1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Hugl-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus LLGL1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione LLGL1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Hugl-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus LLGL1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Hugl-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Hugl-1 nelle cellule tumorali con espressione di LLGL1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.