H⁺/K⁺ ATPase β Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403057-ACT

ATP4B codifica la subunità β della H+/K+ ATPasi gastrica, una ATPasi di tipo P eterodimerica necessaria per l’assemblaggio, il corretto targeting alla membrana e la stabilità funzionale della pompa protonica nelle cellule parietali. Sostenendo la secrezione di H+ in scambio con K+, ATP4B contribuisce all’acidificazione gastrica, all’omeostasi ionica dell’epitelio e ai processi digestivi dipendenti dal pH. La regolazione dell’espressione di ATP4B interseca vie che governano la differenziazione epiteliale, il traffico di membrana e l’organizzazione dei canalicoli secretori. L’alterata espressione e il riconoscimento immunitario dei componenti della H+/K+ ATPasi gastrica sono stati associati a disfunzioni della mucosa gastrica e a fenotipi di gastrite associata ad autoimmunità, rendendo ATP4B un marcatore utile e un nodo meccanicistico nella ricerca sulla biologia dello stomaco.

H+/K+ ATPase β Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ATP4B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

H+/K+ ATPase β Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ATP4B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ATP4B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di H+/K+ ATPase β. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ATP4B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da H+/K+ ATPase β nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via H+/K+ ATPase β nelle cellule tumorali con espressione di ATP4B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.