HSPA8/HSC70 Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-418508-LAC

HSPA8 (HSC70) codifica uno chaperone della famiglia HSP70 espresso in modo costitutivo, che supporta la proteostasi regolando il ripiegamento proteico ATP-dipendente, il ripiegamento (refolding) e la prevenzione dell’aggregazione. HSC70 coordina l’autofagia mediata da chaperone tramite il targeting lisosomiale dei substrati con motivo KFERQ, partecipa all’endocitosi mediata da clatrina e favorisce la maturazione e il traffico di proteine di segnalazione. Attraverso interazioni con co-chaperoni e con il sistema ubiquitina–proteasoma, influenza le risposte allo stress, la dinamica del citoscheletro e il controllo qualità degli organelli. La disregolazione delle reti di chaperoni collegate a HSPA8 è stata associata a neurodegenerazione, programmi di sopravvivenza delle cellule tumorali e interazioni ospite–patogeno, rendendolo un nodo utile per studi funzionali focalizzati su specifiche vie.

Le particelle di attivazione lentivirale HSPA8/HSC70 (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di HSPA8 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale HSPA8/HSC70 (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione HSPA8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di HSPA8/HSC70. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo HSPA8 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.