HSPA5/BiP/GRP78 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420699-ACT

Il gene murino Hspa5 codifica HSPA5 (BiP/GRP78), uno chaperone della famiglia HSP70 del reticolo endoplasmatico (RE) che si lega ai polipeptidi nascenti, supporta il ripiegamento e l’assemblaggio proteico e regola l’omeostasi del Ca²⁺ nel RE. HSPA5 è un sensore ed effettore centrale della risposta alle proteine mal ripiegate (UPR), coordinando la segnalazione dello stress del RE tramite PERK–EIF2α, IRE1–XBP1 e ATF6 per ripristinare la proteostasi oppure indurre l’apoptosi in caso di stress persistente. Attraverso i suoi ruoli nella degradazione associata al RE (ERAD), nella maturazione della via secretoria e nel controllo qualità, HSPA5 influenza il metabolismo cellulare, l’equilibrio redox e la segnalazione infiammatoria. Un’attività deregolata di HSPA5/UPR è ampiamente studiata in contesti quali neurodegenerazione, stress metabolico e biologia tumorale, dove l’alterata proteostasi e l’adattamento allo stress del RE modellano la sopravvivenza cellulare e le interazioni con il sistema immunitario.

HSPA5/BiP/GRP78 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Hspa5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HSPA5/BiP/GRP78 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Hspa5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Hspa5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HSPA5/BiP/GRP78. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Hspa5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HSPA5/BiP/GRP78 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HSPA5/BiP/GRP78 nelle cellule tumorali con espressione di Hspa5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.