HSP 90 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400605-ACT

HSP90B1 codifica GRP94, uno chaperone della famiglia HSP90 localizzato nel reticolo endoplasmatico, che supporta il ripiegamento, la maturazione e il controllo qualità di proteine secrete e di membrana, incluse integrine e recettori Toll-like. Agisce all’interno della risposta alle proteine mal ripiegate (unfolded protein response, UPR) e delle vie di degradazione associata al reticolo endoplasmatico (ERAD) per mantenere la proteostasi durante lo stress cellulare. Regolando la stabilità e il traffico delle proteine “clienti”, GRP94 influenza la segnalazione immunitaria, l’adesione cellulare e la biologia dei recettori per i fattori di crescita. Un’attività deregolata di HSP90B1 e le risposte allo stress del RE sono state collegate alla progressione tumorale, a fenotipi infiammatori e a squilibri della proteostasi associati alla neurodegenerazione, rendendolo un nodo utile per l’analisi delle vie di segnalazione in modelli cellulari umani.

GRP 94 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HSP90B1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GRP 94 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HSP90B1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HSP90B1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GRP 94. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HSP90B1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GRP 94 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GRP 94 nelle cellule tumorali con espressione di HSP90B1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.