HSP 40 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402810-ACT

DNAJB1 codifica la HSP40 umana (omologo DnaJ, sottofamiglia B, membro 1), un co-chaperone citosolico che collabora con HSP70 per regolare il ripiegamento e il ripiegamento corretto delle proteine, nonché lo smistamento dei substrati ripiegati in modo errato. Stimolando l’attività ATPasica di HSP70, HSP40 supporta la proteostasi durante le risposte allo stress, inclusi shock termico e stress ossidativo, e interagisce con i percorsi che governano il turnover tramite ubiquitina–proteasoma e l’autofagia. L’attività di DNAJB1 influenza le risposte cellulari allo stress proteotossico; la ricerca l’ha collegata a neurodegenerazione, replicazione virale e processi oncogeni, in cui le reti di chaperoni modulano la segnalazione e la stabilità proteica. La deregolazione dell’equilibrio tra chaperoni e co-chaperoni è spesso studiata per il suo impatto su proteine inclini all’aggregazione e su programmi trascrizionali adattativi allo stress.

HSP 40 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DNAJB1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HSP 40 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DNAJB1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DNAJB1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HSP 40. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DNAJB1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HSP 40 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HSP 40 nelle cellule tumorali con espressione di DNAJB1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.