HRT2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404761-ACT

HEY2 umano (HRT2) codifica un repressore trascrizionale di tipo basic helix–loop–helix che funge da effettore canonico a valle della segnalazione Notch. Interagendo con complessi trascrizionali dipendenti da RBPJ/CSL, HRT2 contribuisce a regolare le decisioni sul destino cellulare, la tempistica della differenziazione e il patterning dei tessuti, con ruoli di primo piano nei programmi cardiovascolari e di neurosviluppo. HEY2 modula reti trascrizionali che governano la maturazione della muscolatura liscia e dei cardiomiociti, la specificazione ventricolare e le transizioni epitelio–mesenchimali. Un’espressione deregolata di HEY2 o un’alterata attività della via è stata associata a fenotipi di cardiopatie congenite, tratti legati alle aritmie e stati di differenziazione modificati osservati nel cancro e nei disturbi dello sviluppo.

HRT2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HEY2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HRT2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HEY2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HEY2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HRT2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HEY2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HRT2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HRT2 nelle cellule tumorali con espressione di HEY2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.