HoxB5 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420914-ACT

Hoxb5 codifica il fattore di trascrizione homeobox HoxB5, un regolatore che si lega al DNA in modo sequenza-specifico e che modella l’asse antero‑posteriore, orchestrando l’identità regionale durante l’embriogenesi. Nel topo, HoxB5 contribuisce a coordinare reti regolatorie geniche dello sviluppo che controllano la specificazione delle cellule progenitrici, la tempistica della differenziazione e la morfogenesi dei tessuti, integrandosi con programmi più ampi del cluster HOX e con il controllo trascrizionale mediato dalla cromatina. La sua attività influenza vie che governano l’organogenesi e processi associati all’ematopoiesi e alla cresta neurale, ambiti in cui l’alterazione dell’espressione dei geni HOX è spesso studiata nel contesto di differenziazione deregolata e stati proliferativi. Poiché i fattori HOX occupano posizioni elevate nelle gerarchie regolatorie, Hoxb5 è ampiamente utilizzato per indagare i circuiti trascrizionali dello sviluppo e i meccanismi di programmazione di linea rilevanti per modelli di malattia.

HoxB5 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Hoxb5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HoxB5 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Hoxb5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Hoxb5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HoxB5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Hoxb5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HoxB5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HoxB5 nelle cellule tumorali con espressione di Hoxb5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.