Histone H2A.X Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400538-ACT

H2AFX codifica la variante istonica H2A.X, un componente fondamentale della cromatina che viene rapidamente fosforilato in Ser139 (γH2AX) in risposta a rotture a doppio filamento del DNA. Questa modifica innesca la segnalazione della risposta al danno del DNA reclutando mediatori e fattori di riparo, coordinando le vie chinasiche ATM/ATR, il rimodellamento della cromatina, l’attivazione dei checkpoint e la riparazione tramite giunzione delle estremità non omologa e ricombinazione omologa. La dinamica di H2A.X influenza la tolleranza allo stress replicativo, la stabilità dei telomeri e programmi trascrizionali su scala genomica legati all’integrità della cromatina. La deregolazione della segnalazione associata a H2AFX è frequentemente studiata in contesti di instabilità genomica, stress oncogenico e sensibilità a esposizioni genotossiche.

Histone H2A.X Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di H2AFX senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Histone H2A.X Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus H2AFX nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione H2AFX, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Histone H2A.X. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus H2AFX nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Histone H2A.X nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Histone H2A.X nelle cellule tumorali con espressione di H2AFX silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.