HIF PHD3 Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-403671-LAC

EGLN3 codifica la proteina 3 contenente il dominio della prolil-idrossilasi (HIF PHD3), una diossigenasi sensibile all’ossigeno che idrossila le subunità HIF-α per favorire, in condizioni normossiche, l’ubiquitinazione dipendente da VHL e la successiva degradazione proteasomiale. Modulando la stabilità di HIF, PHD3 regola programmi trascrizionali responsivi all’ipossia che controllano angiogenesi, metabolismo glicolitico, eritropoiesi e sopravvivenza cellulare, ed è coinvolta in meccanismi di controllo a feedback all’interno della via cellulare dell’ipossia. L’attività di EGLN3 è influenzata dalla tensione di ossigeno, dal ferro e dalla disponibilità di 2-ossoglutarato, integrando lo stato metabolico con l’adattamento trascrizionale. Un’alterata regolazione dell’asse EGLN3/HIF è stata associata a contesti quali l’ipossia tumorale, la biologia dell’ischemia-riperfusione e i microambienti infiammatori, supportando studi meccanicistici della segnalazione dipendente dall’ossigeno.

Le particelle di attivazione lentivirale HIF PHD3 (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di EGLN3 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale HIF PHD3 (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione EGLN3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di HIF PHD3. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo EGLN3 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.