G_{β 1} Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420606-ACT

Il gene murino **Gnb1** codifica la subunità **Gβ1** delle proteine G eterotrimeriche, un partner obbligato di **Gγ** che collega i GPCR attivati agli effettori a valle. I complessi contenenti Gβ1 regolano la propagazione del segnale verso vie quali adenilato ciclasi/cAMP, fosfolipasi Cβ/flusso di Ca²⁺, modulazione dei canali ionici e segnalazione MAPK, contribuendo così a modellare la neurotrasmissione, la segnalazione sensoriale e le risposte ormonali. Attraverso il controllo della dinamica dei secondi messaggeri e dei meccanismi di desensibilizzazione dei recettori, Gβ1 influenza decisioni sullo stato cellulare, tra cui eccitabilità, proliferazione e migrazione. Una segnalazione GPCR–proteina G deregolata e un’attività alterata di GNB1 sono state associate a fenotipi neuroevolutivi e neurologici e a squilibri di segnalazione più ampi, rilevanti per processi oncogenici e metabolici in modelli sperimentali.

Gβ 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Gnb1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Gβ 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Gnb1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Gnb1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Gβ 1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Gnb1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Gβ 1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Gβ 1 nelle cellule tumorali con espressione di Gnb1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.