GPSM3 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-430655-ACT

Mouse Gpsm3 codifica GPSM3, un regolatore della segnalazione delle proteine G eterotrimeriche contenente un motivo GoLoco, che modula preferenzialmente le subunità Gα della classe Gi/o e influenza la propagazione del segnale guidata dai GPCR. Modellando lo stato di attivazione delle proteine G e le vie downstream dei secondi messaggeri, GPSM3 contribuisce alle risposte chemiotattiche, alla dinamica del citoscheletro e alla regolazione dipendente dal contesto della segnalazione infiammatoria nelle linee mieloidi e linfoidi. Studi genetici e funzionali hanno collegato un’attività alterata di GPSM3 alla suscettibilità a malattie immunomediate e a variazioni dei fenotipi infiammatori, rendendolo rilevante per analizzare il traffico dei leucociti e l’omeostasi immunitaria. Nei modelli murini, la perturbazione dell’espressione di Gpsm3 viene utilizzata per chiarire come le soglie di segnalazione dei GPCR influenzino le risposte immunitarie innate e adattative.

GPSM3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Gpsm3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GPSM3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Gpsm3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Gpsm3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GPSM3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Gpsm3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GPSM3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GPSM3 nelle cellule tumorali con espressione di Gpsm3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.