GnT-V Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403921-ACT

L’MGAT5 umano codifica la N-acetilglucosaminiltransferasi V (GnT-V), una glicosiltransferasi residente nel Golgi che catalizza la ramificazione β1,6-GlcNAc sugli N-glicani. Questa modificazione aumenta la complessità dei glicani sulle glicoproteine di superficie cellulare e secrete, influenzando la permanenza dei recettori, la risposta ai ligandi e la segnalazione a valle attraverso vie come EGFR/MAPK e PI3K/AKT. Rimodellando il panorama dei glicani, MGAT5 contribuisce alla regolazione dell’adesione cellula–cellula, della migrazione e della funzione dei recettori immunitari tramite la formazione di reticoli mediati dalle galectine e un traffico intracellulare alterato. Un’attività deregolata di MGAT5 e la ramificazione β1,6 sono state associate a cambiamenti nell’invasività delle cellule tumorali, a fenotipi metastatici e alla modulazione immunitaria, rendendolo un tema ricorrente negli studi di glicobiologia del cancro e della segnalazione nel microambiente.

GnT-V Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MGAT5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GnT-V Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MGAT5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MGAT5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GnT-V. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MGAT5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GnT-V nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GnT-V nelle cellule tumorali con espressione di MGAT5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.