FGF-23 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401831-ACT

Il fattore di crescita dei fibroblasti 23 (FGF23) codifica la proteina endocrina FGF-23, un regolatore chiave dell’omeostasi sistemica del fosfato e della vitamina D. Secreto principalmente da osteociti e osteoblasti, FGF-23 segnala attraverso i recettori FGFR in modo dipendente da Klotho per sopprimere il riassorbimento renale del fosfato e ridurre la sintesi di 1,25-diidrossivitamina D, integrando il crosstalk endocrino osso–rene. Un’espressione deregolata di FGF-23 è associata a disturbi ereditari e acquisiti del metabolismo minerale, tra cui rachitismo/osteomalacia ipofosfatemici, osteomalacia indotta da tumore e disordine minerale e osseo correlato alla malattia renale cronica. In quanto nodo di via che collega il trasporto del fosfato, il metabolismo della vitamina D e la segnalazione FGF/FGFR, FGF-23 è ampiamente studiato nella fisiologia renale, nella biologia dello scheletro e nelle risposte allo stress cardiometabolico.

FGF-23 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FGF23 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FGF-23 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FGF23 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FGF23, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FGF-23. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FGF23 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FGF-23 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FGF-23 nelle cellule tumorali con espressione di FGF23 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.