FAT4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405268-ACT

FAT4 umano codifica una caderina atipica che si localizza nelle giunzioni cellula–cellula e contribuisce alla polarità planare delle cellule, alla morfogenesi tissutale e al controllo della crescita dipendente dal contatto. FAT4 agisce all’interno della rete di segnalazione Hippo influenzando l’attività delle chinasi principali e gli output trascrizionali a valle che regolano proliferazione, apoptosi e organizzazione epiteliale. Attraverso ruoli nel coordinamento del citoscheletro e nell’instaurazione della polarità, FAT4 influisce sul patterning dello sviluppo e sul mantenimento dell’architettura dei tessuti. La deregolazione o la perdita di FAT4 è stata associata ad alterazioni dei programmi di polarità e a fenotipi rilevanti per i tumori, rendendola un bersaglio utile per studi meccanicistici sul controllo della crescita e sull’integrità epiteliale.

FAT4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FAT4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FAT4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FAT4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FAT4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FAT4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FAT4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FAT4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FAT4 nelle cellule tumorali con espressione di FAT4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.