FAT1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-410778-ACT

FAT1 codifica una caderina atipica che contribuisce all’adesione cellula–cellula, alla polarità epiteliale e alla regolazione dell’organizzazione del citoscheletro durante la morfogenesi dei tessuti. Attraverso interazioni che influenzano la segnalazione della via Hippo e i programmi di polarità planare, FAT1 aiuta a coordinare il controllo della crescita dipendente dal contatto, la migrazione e l’organizzazione direzionale delle cellule. Un’espressione deregolata o mutazioni di FAT1 sono state associate ad alterazioni delle dinamiche di adesione e a stati di segnalazione anomali implicati nella biologia del cancro e nei disturbi dello sviluppo. Nei modelli cellulari umani, FAT1 viene spesso studiato per i suoi ruoli in fenotipi associati all’invasione, nella meccanotrasduzione e nel controllo trascrizionale a valle di segnali provenienti dalle giunzioni cellulari.

FAT1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FAT1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FAT1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FAT1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FAT1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FAT1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FAT1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FAT1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FAT1 nelle cellule tumorali con espressione di FAT1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.