EYA4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404355-ACT

EYA4 codifica un membro della famiglia Eyes Absent (EYA) che funge da coattivatore della trascrizione e fosfatasi, integrando programmi trascrizionali dello sviluppo con una regolazione del destino cellulare sensibile ai segnali. EYA4 partecipa a reti di regolazione genica che influenzano differenziamento, organogenesi e mantenimento dei sistemi sensoriali, e può interfacciarsi con vie che controllano l’output trascrizionale nucleare e la segnalazione in risposta allo stress. Nella biologia umana, alterazioni dell’attività o dell’espressione di EYA4 sono state associate a fenotipi che coinvolgono la funzione uditiva e la cardiomiopatia, rendendolo un bersaglio rilevante per studiare i meccanismi di omeostasi e disfunzione tissutale. I ricercatori studiano comunemente EYA4 per comprendere come cofattori trascrizionali e attività fosfatasiche coordinino l’espressione genica specifica di linea e l’adattamento cellulare.

EYA4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EYA4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EYA4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EYA4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EYA4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EYA4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EYA4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EYA4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EYA4 nelle cellule tumorali con espressione di EYA4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.