ERK 3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403457-ACT

MAPK6 codifica la chinasi 3 regolata da segnali extracellulari (ERK3), una chinasi MAP atipica che integra segnali mitogenici e legati allo stress per regolare la crescita cellulare, la differenziazione, la migrazione e la dinamica del citoscheletro. La segnalazione di ERK3 è collegata alla regolazione a valle di programmi trascrizionali e reti di chinasi che influenzano la progressione del ciclo cellulare e la motilità, inclusi casi riportati di accoppiamento funzionale con chinasi come MK5 in contesti specifici. Un’espressione o un’attività deregolata di MAPK6/ERK3 è stata associata ad alterazioni dei fenotipi proliferativi e invasivi in diversi sistemi modello, a supporto della sua rilevanza nella biologia del cancro e in altre patologie che coinvolgono segnalazione aberrante e rimodellamento tissutale. In quanto MAPK non canonica, ERK3 rappresenta un punto d’ingresso complementare per studiare la diversità delle vie MAPK oltre la classica cascata ERK1/2.

ERK 3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MAPK6 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ERK 3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MAPK6 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MAPK6, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ERK 3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MAPK6 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ERK 3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ERK 3 nelle cellule tumorali con espressione di MAPK6 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.