ERK 1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400010-ACT

MAPK3 codifica la chinasi 1 regolata da segnali extracellulari (ERK1), una chinasi serina/treonina che agisce come effettore centrale della cascata MAPK RAS–RAF–MEK–ERK. ERK1 trasduce segnali provenienti da fattori di crescita, citochine e stimoli di stress per regolare programmi trascrizionali che controllano proliferazione, differenziamento, metabolismo e sopravvivenza cellulare, attraverso la fosforilazione di substrati nucleari e citoplasmatici. Questa via coordina la progressione del ciclo cellulare, l’espressione dei geni a risposta immediata e la regolazione a feedback di recettori e chinasi a monte. Una segnalazione ERK deregolata è spesso implicata in reti di segnalazione oncogeniche e in fenotipi infiammatori o neurobiologici, rendendo MAPK3 un nodo comune per studi meccanicistici sul rimaneggiamento della via e su output di segnalazione dipendenti dal contesto.

ERK 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MAPK3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ERK 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MAPK3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MAPK3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ERK 1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MAPK3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ERK 1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ERK 1 nelle cellule tumorali con espressione di MAPK3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.