epiplakin 1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404271-ACT

EPPK1 codifica epiplakina 1, un grande citolinker della famiglia delle plachine che si associa ai filamenti intermedi di cheratina e contribuisce all’organizzazione del citoscheletro e alla stabilità meccanica dell’epitelio. Agendo da impalcatura per le reti filamentose, l’epiplakina influenza processi quali adesione cellulare, migrazione e risposte allo stress, che sono parte integrante dell’omeostasi epiteliale e dell’integrità della barriera. Un’alterata connessione citoscheletrica e un’architettura epiteliale compromessa sono spesso implicate nel danno tissutale e nel rimodellamento, rendendo EPPK1 un marcatore rilevante per studiare gli stati di differenziamento epiteliale e la riorganizzazione indotta dallo stress. La sua espressione e le funzioni associate ai filamenti sono quindi di interesse in ambiti di ricerca che spaziano dalla biologia dell’epitelio al danno tissutale associato all’infiammazione, fino alla plasticità delle cellule tumorali.

epiplakin 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EPPK1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

epiplakin 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EPPK1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EPPK1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di epiplakin 1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EPPK1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da epiplakin 1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via epiplakin 1 nelle cellule tumorali con espressione di EPPK1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.