Ep-CAM Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400220-ACT

EPCAM codifica la molecola di adesione cellulare epiteliale (Ep-CAM), una glicoproteina transmembrana che media l’adesione omofilica cellula–cellula e contribuisce all’organizzazione dell’integrità epiteliale, della polarità e della segnalazione a livello delle giunzioni. Oltre all’adesione, Ep-CAM partecipa alla proteolisi intramembrana regolata e a programmi trascrizionali a valle che si intrecciano con vie di proliferazione e differenziamento, inclusa l’interazione con reti associate a Wnt/β-catenina. Alterazioni dell’espressione o della localizzazione di EPCAM sono frequentemente studiate nella biologia dei tumori epiteliali, nei fenotipi associati alla metastasi e nei modelli di transizione epitelio–mesenchimale, e varianti loss-of-function di EPCAM sono collegate a patologie intestinali congenite come l’enteropatia a ciuffi (tufting enteropathy). In quanto antigene di superficie e marker di linea, Ep-CAM è inoltre ampiamente utilizzata per definire sottopopolazioni epiteliali e per analizzare transizioni di stato cellulare in sistemi rilevanti per lo sviluppo e la malattia.

Ep-CAM Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EPCAM senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Ep-CAM Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EPCAM nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EPCAM, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Ep-CAM. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EPCAM nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Ep-CAM nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Ep-CAM nelle cellule tumorali con espressione di EPCAM silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.