Ep-CAM Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400220-ACT

EPCAM codifica a molécula de adesão celular epitelial (Ep-CAM), uma glicoproteína transmembrana que medeia a adesão homofílica célula–célula e ajuda a organizar a integridade epitelial, a polaridade e a sinalização em junções. Para além da adesão, a Ep-CAM participa na proteólise intramembranar regulada e em programas transcricionais a jusante que se cruzam com vias de proliferação e diferenciação, incluindo crosstalk com redes associadas a Wnt/β-catenina. Alterações na expressão ou na localização de EPCAM são frequentemente estudadas na biologia de tumores epiteliais, em fenótipos associados à metástase e em modelos de transição epitélio–mesênquima, e variantes de perda de função de EPCAM estão ligadas a perturbações intestinais congénitas, como a enteropatia por tufos (tufting enteropathy). Como antigénio de superfície e marcador de linhagem, a Ep-CAM também é amplamente utilizada para definir subpopulações epiteliais e para investigar transições de estado celular em sistemas relevantes para o desenvolvimento e para a doença.

Ep-CAM O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de EPCAM sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Ep-CAM O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus EPCAM em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição EPCAM, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Ep-CAM. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus EPCAM nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Ep-CAM no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Ep-CAM em células tumorais com expressão de EPCAM silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.