DR3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403461-ACT

TNFRSF25 codifica il recettore di morte 3 (DR3), un membro della superfamiglia dei recettori del TNF espresso prevalentemente in sottopopolazioni di cellule immunitarie, dove modula l’attivazione dei linfociti, la sopravvivenza e la produzione di citochine. DR3 viene attivato da TNFSF15 (TL1A) per avviare una segnalazione prossimale al recettore che può convergere sulle vie di NF-κB e delle MAPK, plasmando programmi genici infiammatori e le funzioni effettrici delle cellule T. Attraverso il suo death domain, DR3 può anche interfacciarsi, in modo dipendente dal contesto, con complessi di segnalazione associati ad apoptosi e necroptosi, collegando l’attivazione immunitaria alla morte cellulare regolata. Un’alterata segnalazione TL1A–DR3 è stata implicata nell’infiammazione immuno-mediata e nel rimodellamento tissutale, rendendo TNFRSF25 un nodo utile per studiare i meccanismi della patologia infiammatoria cronica e dell’omeostasi immunitaria.

DR3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TNFRSF25 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DR3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TNFRSF25 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TNFRSF25, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DR3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TNFRSF25 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DR3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DR3 nelle cellule tumorali con espressione di TNFRSF25 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.