Plasmide CRISPR d'Activation (h) Dkk-3: sc-402970-ACT

Le gène humain DKK3 code la protéine 3 apparentée à Dickkopf (Dkk-3), une glycoprotéine sécrétée impliquée dans la régulation de la signalisation Wnt/β-caténine ainsi que, plus largement, dans le contrôle des décisions de destinée cellulaire, de la différenciation et du remodelage tissulaire. L’activité de Dkk-3 a été associée à la modulation de la transition épithélio-mésenchymateuse, des interactions avec la matrice extracellulaire et des voies de réponse au stress qui influencent la prolifération et l’apoptose. Des profils d’expression altérés de DKK3 ont été rapportés dans de multiples contextes tumoraux ainsi que dans des microenvironnements fibreux et inflammatoires, ce qui étaye son utilisation comme nœud mécanistique pour étudier les interactions entre voies et les sorties de signalisation dépendantes du contexte. En tant que membre non canonique de la famille Dickkopf, Dkk-3 constitue un point d’entrée utile pour disséquer les programmes transcriptionnels associés à Wnt et la biologie des facteurs sécrétés dans les cellules humaines.

Dkk-3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DKK3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Dkk-3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DKK3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DKK3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Dkk-3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DKK3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Dkk-3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Dkk-3 dans les cellules tumorales présentant une expression de DKK3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.