DHODH Plasmide Double Nickase (h): sc-402983-NIC

La DHODH (diidroorotato deidrogenasi) umana è una flavoproteina della membrana interna mitocondriale che catalizza l’ossidazione, tappa limitante della velocità, del diidroorotato a orotato nella biosintesi de novo delle pirimidine, accoppiando la produzione di nucleotidi alla catena respiratoria tramite l’ubichinone. Controllando la disponibilità di UMP, la DHODH influenza la sintesi di DNA/RNA, la progressione della fase S e la capacità proliferativa, e contribuisce alla riprogrammazione metabolica in condizioni di stress da carenza di nutrienti. L’attività della DHODH collega la bioenergetica mitocondriale con l’omeostasi dei nucleotidi e può modulare l’equilibrio redox attraverso il trasferimento di elettroni alla catena di trasporto degli elettroni. La deregolazione del metabolismo delle pirimidine e una dipendenza alterata dalla DHODH sono state implicate in contesti di rapida divisione cellulare e disfunzione mitocondriale, rendendo la DHODH un nodo utile per studiare vulnerabilità metaboliche e regolazione del ciclo cellulare.

DHODH Il plasmide Double Nickase (h) consiste in una coppia di plasmidi ingegnerizzati per l'editing ad alta specificità del locus DHODH nelle linee cellulari human. Ciascun plasmide esprime una nickasi Cas9 D10A e un sgRNA distinto che prende di mira filamenti di DNA opposti all'interno di DHODH. Quando indirizzate verso siti adiacenti su filamenti di DNA opposti, le due nickasi generano tagli a filamento singolo sfalsati che insieme producono una rottura a doppio filamento sfalsata, richiedendo un'attività coordinata sul bersaglio da entrambe le guide. La rottura del DNA risultante viene risolta da vie di riparazione cellulare endogene, più comunemente attraverso la giunzione non omologa delle estremità (NHEJ), portando a inserzioni o delezioni che interrompono la funzione di DHODH. Richiedendo il coinvolgimento di due sgRNA nel locus bersaglio, l'approccio a doppia nickasi migliora la specificità dell'editing e fornisce una strategia CRISPR complementare per applicazioni in cui è desiderato un controllo aggiuntivo sulla precisione del targeting.

Per supportare l'identificazione efficiente delle cellule modificate, un plasmide codifica la GFP per la visualizzazione fluorescente delle popolazioni trasfettate, mentre il plasmide di accompagnamento porta un gene di resistenza alla puromicina per la selezione antibiotica. Insieme, queste caratteristiche supportano l'arricchimento efficiente delle popolazioni co-trasfettate e semplificano la convalida dei cloni con DHODH interrotto.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.