Plasmide CRISPR d'Activation (m) DDIT3/CHOP/GADD153: sc-419970-ACT

Ddit3 code pour le facteur de transcription inductible par le stress DDIT3/CHOP/GADD153, un effecteur central de la réponse intégrée au stress et de la réponse aux protéines mal repliées (UPR) déclenchée par le stress du réticulum endoplasmique (RE). CHOP forme des hétérodimères avec des membres de la famille C/EBP afin de remanier des programmes d’expression génique qui influencent l’apoptose, l’autophagie, l’équilibre redox et le contrôle du cycle cellulaire lors de stress protéotoxiques et métaboliques. Dans les cellules de souris, Ddit3 est couramment utilisé comme marqueur moléculaire du stress du RE en aval de la signalisation PERK–eIF2α–ATF4, et il interfère également avec des voies de dysfonctionnement mitochondrial et d’inflammation. Une activité dérégulée de Ddit3 a été impliquée dans des modèles de maladies métaboliques, de neurodégénérescence, de lésions tissulaires et de biologie tumorale, ce qui étaye son utilisation dans des études mécanistiques sur l’adaptation au stress et les décisions de destin cellulaire.

DDIT3/GADD153/CHOP Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Ddit3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DDIT3/GADD153/CHOP Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Ddit3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Ddit3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DDIT3/GADD153/CHOP. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Ddit3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DDIT3/GADD153/CHOP au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DDIT3/GADD153/CHOP dans les cellules tumorales présentant une expression de Ddit3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.