cyclin E2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402500-ACT

CCNE2 kodiert Cyclin E2, ein regulatorisches Cyclin, das an CDK2 bindet und es aktiviert, um den G1/S-Übergang und den Beginn der DNA-Replikation zu fördern. Cyclin E2 verknüpft mitogene Signale mit der Kontrolle von Zellzyklus-Checkpoints, indem es die Phosphorylierung nachgeschalteter Substrate moduliert, die am „Firing“ von Replikationsursprüngen und am Eintritt in die S‑Phase beteiligt sind. Eine fehlregulierte CCNE2-Expression kann die Genomstabilität und Antworten auf Replikationsstress beeinträchtigen und ist daher relevant für Studien zu proliferativen Signalwegen, DNA-Schadentoleranz und zellzyklusassoziierten Transkriptionsprogrammen. CCNE2 wird deshalb häufig als molekularer Ansatzpunkt genutzt, um CDK2-getriebene Netzwerke, das Timing des Zellzyklus und Mechanismen zu untersuchen, die die Replikationskontrolle mit Modellen der onkogenen Transformation koppeln.

cyclin E2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CCNE2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

cyclin E2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CCNE2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CCNE2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen cyclin E2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CCNE2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von cyclin E2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des cyclin E2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CCNE2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.