cyclin E2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402500-ACT

CCNE2 codifica la ciclina E2, una ciclina regolatoria che si lega a CDK2 e la attiva per promuovere la transizione G1/S e l’avvio della replicazione del DNA. La ciclina E2 integra i segnali mitogenici con il controllo dei checkpoint del ciclo cellulare modulando la fosforilazione di substrati a valle coinvolti nell’attivazione delle origini di replicazione e nell’ingresso in fase S. Un’espressione deregolata di CCNE2 può compromettere la stabilità del genoma e le risposte allo stress replicativo, rendendola rilevante per studi sulla segnalazione proliferativa, sulla tolleranza al danno del DNA e sui programmi trascrizionali associati al ciclo cellulare. CCNE2 è quindi ampiamente utilizzato come strumento molecolare per interrogare le reti guidate da CDK2, la tempistica del ciclo cellulare e i meccanismi che collegano il controllo della replicazione a modelli di trasformazione oncogenica.

cyclin E2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CCNE2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

cyclin E2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CCNE2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CCNE2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di cyclin E2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CCNE2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da cyclin E2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via cyclin E2 nelle cellule tumorali con espressione di CCNE2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.