COL5A1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401579-ACT

COL5A1 codifica la catena pro‑α1(V) del collagene di tipo V, un collagene fibrillare che si co-assembla con il collagene di tipo I per regolare la fibrillogenesi del collagene e l’architettura della matrice extracellulare (ECM). Controllando la nucleazione e il diametro delle fibre collagene, COL5A1 influenza la resistenza alla trazione del tessuto connettivo, l’adesione cellula–matrice e i programmi di meccanotrasduzione che modellano lo sviluppo e il rimodellamento dei tessuti. L’organizzazione dell’ECM associata a COL5A1 si interseca con vie che governano la riparazione delle ferite e il rimodellamento stromale, incluse la segnalazione integrina/FAK e la deposizione di matrice collegata a TGF‑β. Alterazioni genetiche di COL5A1 sono implicate in disordini ereditari del tessuto connettivo e una sua espressione alterata è spesso studiata nella fibrosi e nella biologia del microambiente tumorale.

COL5A1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di COL5A1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

COL5A1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus COL5A1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione COL5A1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di COL5A1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus COL5A1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da COL5A1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via COL5A1 nelle cellule tumorali con espressione di COL5A1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.