Cdk9 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400242-ACT

Il gene umano **CDK9** codifica la chinasi ciclino-dipendente 9 (Cdk9), la subunità catalitica del fattore positivo di elongazione trascrizionale b (P-TEFb), che fosforila il dominio C-terminale della RNA polimerasi II per promuovere un’elongazione trascrizionale produttiva. Attraverso la regolazione del rilascio dalla pausa prossimale al promotore, Cdk9 coordina l’espressione di geni a risposta immediata, programmi di risposta allo stress e regolatori del ciclo cellulare e della sopravvivenza, integrando segnali provenienti da coattivatori trascrizionali e fattori associati alla cromatina. L’attività di CDK9 influenza il processamento dell’RNA e la stabilità del genoma modulando eventi accoppiati alla trascrizione e controllando la cinetica dell’espressione genica. Una segnalazione CDK9/P-TEFb deregolata è frequentemente associata a dipendenze trascrizionali aberranti rilevanti per la biologia del cancro, la segnalazione infiammatoria e il controllo trascrizionale virus–ospite, rendendolo un nodo ampiamente utilizzato per studi meccanicistici della trascrizione.

Cdk9 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CDK9 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Cdk9 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CDK9 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CDK9, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Cdk9. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CDK9 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Cdk9 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Cdk9 nelle cellule tumorali con espressione di CDK9 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.