Cdk8 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400577-ACT

CDK8 codifica la chinasi ciclina‑dipendente 8 (Cdk8), una subunità catalitica del modulo chinasi del complesso Mediator che integra segnali di input con la trascrizione dipendente dalla RNA polimerasi II. Cdk8 regola l’inizio e l’allungamento della trascrizione modulando l’attività di Mediator e fosforilando fattori associati alla trascrizione, contribuendo così a definire programmi di espressione genica specifici del contesto. Attraverso queste funzioni, CDK8 partecipa a vie che governano la progressione del ciclo cellulare, la differenziazione, le risposte allo stress e la segnalazione infiammatoria, inclusa l’interazione (crosstalk) con Wnt/β‑catenina e con altre reti trascrizionali oncogeniche. Un’espressione o un’attività deregolata di CDK8 è stata collegata ad alterazioni del controllo trascrizionale in molteplici contesti rilevanti per la malattia, a supporto del suo impiego come nodo meccanicistico per studiare il rimodellamento dei circuiti trascrizionali.

Cdk8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CDK8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Cdk8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CDK8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CDK8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Cdk8. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CDK8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Cdk8 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Cdk8 nelle cellule tumorali con espressione di CDK8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.