Cdc42EP4 Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-408523-LAC

CDC42EP4 codifica Cdc42EP4, una proteina effettrice di Cdc42 della famiglia Borg/CEP che collega la segnalazione delle Rho GTPasi al rimodellamento del citoscheletro di actina e septine. Coordinando l’organizzazione dei filamenti e delle strutture contrattili, Cdc42EP4 contribuisce al controllo della forma cellulare, all’adesione, alla polarità e ai programmi di migrazione che sono centrali per la morfogenesi dei tessuti e per la meccanobiologia cellulare. Output deregolati della via di CDC42 e la riorganizzazione del citoscheletro sono spesso implicati nel comportamento invasivo, in interazioni alterate con lo stroma e in altri fenotipi rilevanti per la ricerca sul cancro e sulle malattie infiammatorie. In quanto nodo di lettura a valle di Cdc42, Cdc42EP4 offre uno strumento maneggevole per interrogare l’architettura del citoscheletro e i cambiamenti della motilità dipendenti dal segnale.

Le particelle di attivazione lentivirale Cdc42EP4 (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di CDC42EP4 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale Cdc42EP4 (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione CDC42EP4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di Cdc42EP4. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo CDC42EP4 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.